0512-86860966
MORE
摘要
檢驗(yàn)或活化霉菌及酵母菌常使用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(Potato dextrose
agar, PDA)，因?yàn)?span lang="EN-US">PDA含有 豐富碳素源及氮素源，一些乳酸菌亦可于此培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，用于檢測(cè)含活性乳酸菌食品時(shí)易導(dǎo)致偽陽(yáng)性的
產(chǎn)生而誤判檢測(cè)結(jié)果。本研究以酸液調(diào)整PDA之pH值使乳酸菌在酸化PDA中不生長(zhǎng)，而維持霉菌及酵母 菌之生長(zhǎng)活性。研究結(jié)果顯示在pH 2.5~3.5環(huán)境下，乳酸菌在PDA無(wú)法生長(zhǎng)，但霉菌及酵母菌不受低pH 環(huán)境影響，因此吾等認(rèn)為利用酸化PDA檢測(cè)乳酸菌食品中的霉菌及酵母菌將更為準(zhǔn)確。
關(guān)鍵詞：食品微生物檢驗(yàn)、乳酸菌、霉菌及酵母菌、酸化PDA
前言
臺(tái)灣保健食品市場(chǎng)規(guī)模隨著我國(guó)健康意 識(shí)提升而成長(zhǎng)，2017年通過(guò)審查的保健食品 前五大功效要求為調(diào)節(jié)血脂、胃腸功能改善、
免疫調(diào)節(jié)、護(hù)肝、骨質(zhì)保健[1]。根據(jù)國(guó)內(nèi)外 研究顯示乳酸菌有改善腸道菌相、增強(qiáng)免疫 功能、降膽固醇、降血脂或減少體脂肪形成
等功效，食品中常以乳酸菌做為益生菌原料。 隨著國(guó)人生活水平上升，對(duì)于食品衛(wèi)生要求 愈發(fā)嚴(yán)格。檢測(cè)方法進(jìn)行含乳酸活菌產(chǎn)品時(shí)， 若是以PDA為檢測(cè)培養(yǎng)基，檢測(cè)結(jié)果容易因 乳酸活菌生長(zhǎng)于PDA中而有偽陽(yáng)性。目前市
面上已有多種乳酸活菌產(chǎn)品，然而檢驗(yàn)乳酸 活菌產(chǎn)品中霉菌及酵母菌時(shí)，因乳酸活菌能 生長(zhǎng)于PDA上，導(dǎo)致不易判斷產(chǎn)品是否被霉
菌或酵母菌所污染。文獻(xiàn)指出酸可抑制乳酸
菌生長(zhǎng)[2]，而霉菌及酵母菌耐酸性較佳[3]， 因此本研究欲以酸液調(diào)整PDA之 pH值，在 不影響霉菌及酵母菌生長(zhǎng)的前提下，使乳酸 活菌不生長(zhǎng)于PDA上。
材料與方法
培養(yǎng)基、試劑 BD DifcoTM Potato Dextrose Broth（馬 鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基；PDB）、BD DifcoTM Lactobacilli MRS Broth（乳酸桿菌 MRS 培 養(yǎng)基）、BD DifcoTM Agar（洋菜）皆購(gòu)買自 啟新生物科技有限公司，新北市。鹽酸(HCl) 購(gòu)自Sigma-Aldrich（德國(guó)）、85%磷酸(H3PO3) 購(gòu)自第一化工原料股份有限公司（臺(tái)灣）、 檸檬酸(Cirtric acid)購(gòu)自三福化工股份有限 公司（中國(guó)）、蘋果酸(Malic
acid)購(gòu)自國(guó)華 貿(mào)易股份有限公司（日本）。
10%(w/w)酸液制備 將 37%鹽酸、85%磷酸、檸檬酸粉末、
蘋果酸粉末分別加入無(wú)菌水中混勻至濃度為
10%(w/w)，以0.22 m filter 過(guò)濾至無(wú)菌離 心管內(nèi)備用。
實(shí)驗(yàn)菌種 Lactobacillus plantarum (BCRC 10069)、 Lactococcus lactis (BCRC 12312)、Lactobacillus
rhamnosus (BCRC 16000)、Lactobacillus paracasei (BCRC
16100)、Pediococcus pentosaceus (BCRC 10068)、Aspergillus oryzae (BCRC 30289)、Saccharomyces
cerevisiae (BCRC 21800)以上菌株皆購(gòu)自財(cái)團(tuán)法人食品 工業(yè)發(fā)展研究所生資中心（新竹，臺(tái)灣）。
菌株活化 乳酸菌菌液制備 : 將乳酸菌冷凍保存管 以無(wú)菌接種環(huán)沾取至Lactobacilli MRS平板 進(jìn)行四區(qū)劃線，倒置37℃于厭氧環(huán)境培養(yǎng) 48±2小時(shí)，培養(yǎng)完畢再將單一菌落以無(wú)菌接 種環(huán)沾取至Lactobacilli MRS Broth中，37℃ 于厭氧環(huán)境培養(yǎng)16~18小時(shí)。 真菌菌液制備 : 將霉菌或酵母菌之純菌 冷凍保存管以無(wú)菌接種環(huán)進(jìn)行四區(qū)劃線接種
至PDA平板，正放25℃培養(yǎng)5-7天，活化后
真菌平板以無(wú)菌接種環(huán)取單一菌落接種至 PDB，培養(yǎng)于25℃培養(yǎng)5-7天備用。
酸化馬鈴薯葡萄糖洋菜培養(yǎng)基（酸化 PDA） 制備 將 PDB 粉末加入總體積2% Agar，以 121℃高溫高壓滅菌15分鐘，冷卻至45-50℃， 加入先前制備好之酸液由pH 5.1調(diào)整pH至 3.8、3.5、3.0與 2.5。 酸化 PDA 配制方法經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表 1，不同酸液調(diào)整至pH 3.8 (±0.1)使用酸液量
不同。 由 HCl配制酸化PDA調(diào)整至不同pH值 使用酸量如表2。
乳酸菌數(shù)檢測(cè) 利用傾注平板法進(jìn)行乳酸菌數(shù)計(jì)數(shù)，操 作方法如下：取乳酸活菌菌液1 mL以 1% peptone water 進(jìn)行序列稀釋，稀釋至10-6、 10-7，各稀釋液分別取1mL 至無(wú)菌培養(yǎng)皿， 再倒入15~20 mL經(jīng)滅菌完成冷卻至45-50℃ 之Lactobacilli MRS agar，執(zhí)行平板兩重復(fù)， 待平板冷卻凝固后倒置培養(yǎng)于37℃厭氧環(huán)境 48 ± 2小時(shí)，培養(yǎng)后計(jì)數(shù)平板上的單一菌落， 菌落計(jì)數(shù)范圍介于25~250 CFU 之間，兩平 板菌落數(shù)平均后得實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
霉菌與酵母菌檢測(cè) 利用傾注法進(jìn)行真菌活性檢測(cè)，操作方 法如下：將活化好之真菌菌液，經(jīng)培養(yǎng)后以 傾注平板法培養(yǎng)于PDA 于 25℃培養(yǎng)5-7天， 觀察生長(zhǎng)活性狀況。
乳酸菌于PDA上生長(zhǎng)活性測(cè)試 同上述乳酸菌檢測(cè)方式，將乳酸菌以傾 注平板法檢測(cè)，培養(yǎng)條件比照霉菌與酵母菌，
培養(yǎng)基使用PDA取代Lactobacilli MRS agar，
倒置培養(yǎng)于25℃培養(yǎng)5-7天，培養(yǎng)后計(jì)數(shù)平 板上的單一菌落，菌落計(jì)數(shù)范圍介于25~250 CFU之間，兩平板菌落數(shù)平均后得實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
酸性PDA對(duì)于乳酸菌與真菌生長(zhǎng)活性測(cè)試 乳酸菌實(shí)驗(yàn)方法同上述乳酸菌于PDA上 生長(zhǎng)活性測(cè)試，使用培養(yǎng)基為酸化PDA，倒 置培養(yǎng)于25℃培養(yǎng)5-7天，培養(yǎng)后計(jì)數(shù)平板 上的單一菌落，菌落計(jì)數(shù)范圍介于25~250 CFU之間，兩平板菌落數(shù)平均后得實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 霉菌與酵母菌實(shí)驗(yàn)方法同上述霉菌與酵 母菌檢測(cè)，將霉菌、酵母菌以傾注法于各酸
化PDA，正放于25℃培養(yǎng)5-7天，經(jīng)培養(yǎng)后
觀察菌落型態(tài)生長(zhǎng)活性狀況。
結(jié)果
為評(píng)估乳酸菌于PDA之生長(zhǎng)狀況，本研 究將乳酸菌活化后經(jīng)序列稀釋至適當(dāng)稀釋倍 數(shù)后以傾注培養(yǎng)于MRSA及PDA，結(jié)果如表 3 所示，乳酸菌以傾注平板法接種于 MRS agar 及 PDA，乳酸菌于兩種培養(yǎng)基皆可生 長(zhǎng)，并且其菌落數(shù)目無(wú)明顯差異。乳酸菌于 MRSA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)活性較佳，菌落呈白色 明顯肉眼可見(jiàn)，但由于PDA是霉菌與酵母菌
通用培養(yǎng)基，乳酸活菌雖然可以生長(zhǎng)于此培 養(yǎng)基上，但對(duì)于部分乳酸菌較為不適，而生 長(zhǎng)出的乳酸菌菌落形態(tài)會(huì)偏細(xì)小，較不易計(jì) 數(shù)。 藉由不同酸液調(diào)整至 pH 3.8之 PDA 確 認(rèn)乳酸菌于一般酸化PDA生長(zhǎng)活性。由表4 結(jié)果顯示部分乳酸菌由調(diào)整至pH 3.8 PDA傾 注培養(yǎng)幾乎沒(méi)有活性，但是 Lactobacillus
plantarum 較為耐酸，活性較強(qiáng)，于 pH 3.8 之 PDA中菌數(shù)與MRS agar中菌數(shù)無(wú)明顯差 異。 以不同酸液調(diào)整pH值之PDA皆可抑制 大部份乳酸菌的生長(zhǎng)（表4）。以此結(jié)果可 推斷以調(diào)整 pH 方式可以抑制乳酸菌生長(zhǎng)活 性，以 pH 值 3.8之 PDA 雖然可降低大部分
乳酸菌活性，但還是有耐酸特性較強(qiáng)的乳酸 菌無(wú)法被抑制，故以 pH 3.8之酸化 PDA 不 足以客觀表現(xiàn)乳酸活菌產(chǎn)品之衛(wèi)生檢測(cè)結(jié)果。
根據(jù)表4 結(jié)果顯示，由各種酸液調(diào)整pH 之PDA對(duì)于L. plantarum生長(zhǎng)活性無(wú)顯著差 異，為了改進(jìn)此缺點(diǎn)，后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用實(shí)驗(yàn)室 內(nèi)最常見(jiàn)之酸液（鹽酸）制備酸化PDA，再 由上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果改良實(shí)驗(yàn)方法，以10% 鹽酸 酸液調(diào)整 PDA 之 pH，由原始 pH5.1調(diào)整至 pH 3.5、3.0、2.5。各乳酸菌接種至 MRS Broth 37℃培養(yǎng)16~18小時(shí)，再以MRS agar 傾注培養(yǎng)37℃2-3天，同時(shí)以不同pH之PDA 傾注培養(yǎng)25℃5-7天，培養(yǎng)后觀察結(jié)果如表 5。將活性乳酸菌傾注培養(yǎng)于 pH 3.5、3.0、 2.5之 PDA 中，各乳酸菌皆無(wú)法生長(zhǎng)，證明 降低pH值可以抑制乳酸菌活性。 為了確認(rèn)真菌生長(zhǎng)活性不受高酸性環(huán)境 影響，本研究將霉菌與酵母菌以傾注法培養(yǎng) 于不同 pH 之 PDA 平板，再以25℃培養(yǎng)5-7 天，觀察其生長(zhǎng)情形，結(jié)果如圖1、圖2 所 示，代表霉菌的Aspergillus oryzae與代表酵 母菌的 Saccharomyces cerevisiae 皆可于低 pH之PDA平板生長(zhǎng)，由此可知低pH 之PDA 霉菌與酵母菌亦可生長(zhǎng)，觀察酸化PDA平板 生長(zhǎng)之菌落型態(tài)與未調(diào)整pH之 PDA并無(wú)差 異，生長(zhǎng)活性亦無(wú)明顯差別，將PDA酸化可 大幅降低乳酸菌在PDA中檢出機(jī)率，且不影 響霉菌與酵母菌檢測(cè)，進(jìn)而降低檢測(cè)報(bào)告之 偽陽(yáng)性。
討論
依據(jù)本研究結(jié)果乳酸菌于PDA上生長(zhǎng)活 性測(cè)試結(jié)果證明乳酸活菌可被PDA檢出來(lái)。 若以無(wú)經(jīng)處理之PDA檢測(cè)含活性乳酸菌之產(chǎn) 品，檢測(cè)結(jié)果可能會(huì)有偽陽(yáng)性，進(jìn)而影響品
管檢驗(yàn)判定。為使品管檢驗(yàn)更加準(zhǔn)確，必須 開(kāi)發(fā)抑制乳酸菌于PDA之生長(zhǎng)活性方法。本 研究以一般酸化PDA (pH 3.8)確實(shí)可抑制乳 酸菌生長(zhǎng)活性，但有部分乳酸菌耐酸度較強(qiáng)， pH
3.8亦可生長(zhǎng)。由此可知酸化是一個(gè)有效 且可行的方法，但需再作改善，經(jīng)由再降低 pH至 3.5-2.5的PDA確實(shí)能有效抑制乳酸菌 活性，且不影響霉菌與酵母菌生長(zhǎng)活性，因
此，將PDA酸化至pH 3.5-2.5范圍內(nèi)后再檢 驗(yàn)含乳酸活菌產(chǎn)品，可以使衛(wèi)生檢驗(yàn)結(jié)果降
低其偽陽(yáng)性而更加準(zhǔn)確。本研究使用一株酵 母及一株霉菌做為測(cè)試基準(zhǔn)，未來(lái)將進(jìn)一步 測(cè)試多種真菌于酸化PDA生長(zhǎng)情形，以確認(rèn)
酸化PDA檢驗(yàn)適用性。
參考文獻(xiàn)
1. 食品工業(yè)發(fā)展研究所。2018 食品產(chǎn)業(yè)年鑒。 2018.08.08。食品工業(yè)發(fā)展研究所。臺(tái)灣。 2. 林志勛。有機(jī)酸和乳酸菌之相互關(guān)系。現(xiàn)代養(yǎng)豬。 2011; 32:18-20。臺(tái)灣動(dòng)物科技研究所， 臺(tái)灣。 3. 王鳳梅，馬里兵。內(nèi)蒙古西部地區(qū)本土葡萄酒釀酒
酵母發(fā)酵特性研究。2015; 31:204-8，生物技術(shù)通報(bào)。 中國(guó)。 4. 衛(wèi)生福利部食品藥物管理署。食品微生物之檢驗(yàn)方 法－霉菌及酵母菌數(shù)之檢驗(yàn)。2013。2013.09.06部授 食字第 1021950329 號(hào)公告修正。行政院衛(wèi)生福利
部，臺(tái)灣。
